domingo 26 junio, 2022
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Actividad antimicrobiana frente a patógenos periodontales de un gel metamidazol

Montangero V. Grandinetti J, Marino Al .Brusca M. Roldán E. Fac, Odont UAI Inst Invest Meta
Facultad de Odontología UBA
Gador Lab.

Las bolsas gingivales causadas por la enfermedad periodontal y las peri-implantitis post colocación del implante dental, necesitan como complemento del tratamiento odontológico (raspaje y curetaje) el uso de antibióticos con efectos sobre la flora aeróbica y anaeróbica. El uso de antibióticos debe mantenerse durante un tiempo prolongado. Al ser administrados por vía oral, generalmente presenta efectos no deseados, motivo de la suspensión de la medicación por el paciente. Esta falta de adhesión al tratamiento, trae como consecuencia la resistencia bacteriana correspondiente. 

Con el fin de evitar la problemática planteada, la industria farmaceútica provee antibióticos en forma tópica de liberación prolongada. Estos fármacos compuestos por polímeros, que al degradarse liberan la formulación antibiótica, son colocados por el odontólogo dentro de la bolsa periodontal, o de la cavidad peri-implantaria, por medio de anestubos o jeringas prellenadas. 

Dos formulaciones farmaceúticas conteniendo metronidazol o doxicilina son las más utilizadas tanto en EE.UU. como en Europa.

Tabla 1. Halos de inhibición (mm) de cada ensayo por cepa, media de los duplicados y DS.
Microorganismos GEL P DG-2601205
Halos, media y DS (mm)
PLACEBO DG-2531205
Halos media y DS (mm)
  E1 E2 Media DS E1 E2 Media DS
Cepas de colección
Anaerobios
Prevotella intermedia ATCC 25611 76
75 75,5 0,71 9 9 9 0,00
Prevotella nigrescens ATCC 78
77 77,5 0,71 10 10 10 0,00
Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 103
102 102,5 0,71 27 24 25,5 2,12
Fusobacterium nucleatum ATCC 5586 80
79 79,5 0,71 6 6 6 0,00
Tannerella forsythensis ATCC 110
110 110 0,00 6 6 6 0,00
Campylobacter rectus ATCC 75 79 77 2,83 6 6 6 0,00
Aerobios
Eikenella corrodens ATCC 8 8 8 0,00 6 6 6 0,00
Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC 33384 47 45 46 1,41 11 6 8,5 3,54
Cepas aisladas de Placa subgingival1
Anaerobios
Prevotella intermedia/nigrescens2
Pi1 65 67 66 1,41 13 13 13 0,00
Pi2 75 77 76 1,41 6 7 6,5 0,71
Pi3 80 77 78,5 2,12 10 12 11 1,41
Pi4 57 60 58,5 2,12 9 10 9,5 0,71
Pi5 80 76 78 2,83 9 12 10,5 2,12
Porphyromonas gingivalis  
Pi1 80 76 78 2,83 6 9 7,5 2,12
Pi2 80 89 84,5 6,36 16 18 17 1,41
Pi3 79 80 79,5 0,71 18 12 15 4,24
Pi4 78 79 78,5 0,71 12 20 16 5,66
Pi5 79 8 79,5 0,71 17 12 14,5 3,54
Fusobacterium nucleatum  
Fn1 76 75 75,5 0,71 6 6 6 0,00
Fn2 80 82 81 1,41 6 6 6 0,00
Fn3 82 83 82,5 0,71 10 6 8 2,83
Fn4 76 74 75 1,41 6 10 8 2,83
Fn5 78 76 77 1,41 15 10 12,5 3,54
Aerobios  
Actinobacillus actinomycetemcomitans  
Aa1 36 37,5 36,75 1,06 14 16 15 1,41
Aa2 26 30 28 2,83 16 18 17 1,41
Aa3 46 41 43,5 3,54 6 6 6 0,00
Aa4 38 39 38,5 0,71 6 6 6 0,00
Aa5 27 28 27,5 0,7 6 6 6 0,00
E1, ensayo 1; E2, ensayo 2; DS, Desvío Standard; 1, muestras de pacientes con enfermedad periodontal severa, 2, se denomina de esta manera porque las especies no se pueden diferenciar por pruebas bioquímicas convencionales. &, se considera 6 mm, correspondiente al diámetro del pocillo, cuando no hubo halo de inhibición.

La eficacia terapeútica antibiótica de estos productos se ha demostrado in extenso, presentándose frecuentemente el problema de la no degradación completa de los polímeros, quedando restos en estas cavidades, pasando a ser una espina irritativa en el proceso de cicatrización, debiendo el odontólogo realizar un nuevo raspaje de la bolsa para eliminarlos, prolongándose de esta manera el tratamiento. 

El producto a estudiar es un gel de metromidazol de uso tópico en el cual se utiliza el sistema SALFIO. Esta compuesto por un gel bio-adhesivo con un escurrimiento apropiado para penetrar en las bolsas periodontales y surcos periimplantarios con una cánula curva que posibilita el acceso a cualquier parte de la cavidad bucal. El depósito del gel es un tubo multilaminado que impide la variación de la concentración del contenido, brindando estabilidad de la formulación.

Microorganismos (Nro. de cepas/nro. ensayos)
GEL P DG-2601205 
Media ± DS (mm) 
PLACEBO
GEL P DG-2531205 
Media ± DS (mm)
Prevotella intermedia/nigrescens (5/10)
Porphyromonas gingivalis (5/10)
Fusobacterium nucleatum (5/10)
Actinobacillus actinomycetemcomitans (5/10)
71,4 ± 8,81(a)
80,0 ± 2,60(a)
78,2 ± 3,37(a)
34,9 ± 6,94(a)
10,1 ± 2,38(b)
14,0 ± 3,76(b)
8,1 ± 2,66(b)
10,0 ± 5,52(b)
Tabla 2. Media y DS de los halos de inhibición de las cepas clínicas

El metronidazol es un antibiótico que actúa sobre gérmenes Gram negativos y positivos, aerobios y anaerobios, es amibicida y anti protozoario.

Objetivo del Estudio:

– Evaluar la sensibilidad “ in vitro” del GEL P DG- 2601205 mediante el método de difusión en agar frente a cepas de bacilos gran negativos aerobios y anaerobios. 

– Comparar la actividad del Gel P DG- 2601205 con la del gel sin la adición del principio activo. (PLACEBO GEL P 2531205).

Material y Métodos:

Cepas: se utilizaron para el estudio microorganismos relacionados con la formación de la placa subgingival. Se utilizaron cepas de referencia provenientes de la American Type Culture Collection (ATTCC) y cepas aisladas de pacientes con enfermedad periodontal provenientes de la colección del laboratorio, conservadas a -70°C.

Cepas clínicas: se probaron 5 cepas de cada una de las siguientes especies anaerobias: P. intermedia /nigrescens, F.nucleatum, P.gingivalis y 5 cepas de S. actinomycetemcomitans, especie aerobia, aisladas de placa subgingival de pacientes con enfermedad periodontal severa.

Medios de cultivo:

Microorganismos anaerobios: se utilizaron como medio base para recuperación y pruebas de sensibilidad los siguientes medios: a- Agar Brucella suplementado con vitamina K, hemina y 5% de sangre de carnero lacada (Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum y Porphyromonas gingivalis), b-Agar Brucella supementado con vitamina K, hemina y 5% de sangre de carnero al cual se le adiciona formato/fumarato (Campylobacter. Rectus), c-Agar tripticasa soja suplementado con hemina y Ac. N acetil murámico (Tannerella forsythensis).

Microorganismos aerobios: a- Agar tripticasa soja suplementado con extracto de levadura y 10% suero equino (Actinobacillus actinomycetemcomitans) y b- Agar base GC suplementado con isovitalex, hemina y sangre de carnero (Eikenella corrodens).

Pruebas de identificación:

-Bacterias anaerobias: se confirmó la identificación de las cepas utilizadas mediante el control de aerotolerancia negativo y la observación de características macroscópicas (presencia de pigmento, morfología de las colonias), características microscópicas, sensibilidad a discos de potencia especial. 

-Bacterias aerobias: la identificación se basó fundamentalmente en la observación de la colonia característica de A. actinomycetemcomitans sobre el agar TSBV y la producción de catalasa y la identificación de E. corrodens se basó en pruebas bioquímicas convencionales.

Incubación:

-Bacterias anaerobias: las placas se incubaron en atmósfera anaeróbica utilizando generadores comerciales durante 48 hs para todos los microorganismos con excepción de Tannerella forsythensis que requirió 7 a 10 días de incubación.

-Bacterias aerobias: se incubaron en atmósfera aerobia enriquecida con CO2 durante 48 hs.

Las pruebas de sensibilidad se realizaron en los medios donde desarrollaba adecuadamente el microorganismo, descriptos en la sección medios de cultivo. La lectura se realizó midiendo el diámetro del halo con calibre con una precisión de +/-0.5 mm.

Los ensayos se realizaron por duplicado en experiencias separadas.

Pruebas estadísticas:

-Se compararon la diferencia entre las medias de los halos 

Se analizaron los valores obtenidos con las cepas clínicas. Se compararon las medias de los halos del ensayo 1 y el ensayo 2 para cada especie con el GEL P DG-2601205 y con el PLACEBO GEL P DG-2531205. No se obtuvieron diferencias significativas entre ensayos con los respectivos geles (p>0,1). 

Por lo tanto, se calculó la media de los halos de las 10 determinaciones del GEL P DG-2601205 y del PLACEBO GEL 

obtenidos con las cepas de muestras clínicas utilizando la prueba T. 

Resultados

Los resultados de los halos de inhibición, expresados en mm, de cada cepa por duplicado, media y desvío standard (DS) se muestran en la Tabla 1.

Se analizaron los valores obtenidos con las cepas clínicas. Se compararon las medias de los halos del ensayo 1 y el ensayo 2 para cada especie con el GEL P DG 2601205 y con el PLACEBO GEL P DG 2531205. No se obtuvieron diferencias significativas entre ensayos con los respectivos geles (p mayor0.1).

Por lo tanto, se calculó la media de los halos de las 10 determinaciones del GEL P DG 2601205 y del PLACEBO GEL P DG 2531205, para cada especie, P. intermedia, P.gigivalis, F nucleatum y A. actinomycetemcomitans, respectivamente.

En la tabla 2 se muestran la media y DS de los halos de inhibición obtenidos de las 10 determinaciones realizadas a cada uno de los aislamientos clínicos (cinco cepas de cada especie por duplicado).

Conclusiones y Discusión:

.Anaerobios:

-Se observó muy buena actividad del GEL P DG 2601205 frente a las especies anaerobias estrictas con un rango de halos de inhibición de 57 mm a 102 mm.

-No se observó inhibición significativa con el PLACEBO GEL P DG 2531205 con ninguna de las especies estudiadas. Sí bien P. gingivalis fue la especie más inhibida por el placebo ( 18 a 24 mm de halo), la inhibición observada con el GEL P DG 2601205 fue 4 a 5 veces superior a este valor ( p menor 0.001).

.Aerobios:

-Se observó buena actividad del GEL P DG 2601205 frente a las cepas de A.actinomycetemcomitans tanto para las cepas clínicas como para la cepa ATCC 33384. El rango de los halos de inhibición fue de 27 mm a 46 mm, inferiores a los observados con los microorganismos anaerobios ( p menor 0.001).

P DG-2531205, para cada especie, P. intermedia, P. gingivalis, F. nucleatum y A. actinomycetemcomitans, respectivamente.

En la Tabla 2 se muestran la media y DS de los halos de inhibición obtenidos de las 10 determinaciones realizadas a cada uno de los aislamientos clínicos (cinco cepas de cada especie por duplicado). 

-La cepa E. corrodens ATCC 23834 no fue inhibida por el GEL P DG 2601205, el halo fue de 8 mm.

– No se observó inhibición significativacon el PLACEBO GEL P DG 2531205 con ninguna de las dos especies aerobias estudiadas.

Sí bien la técnica utilizada es cualitativa, permite observar acción inhibitoria del GEL P DG 2601205 para la mayoría de las cepas estudiadas. Esta observación se basa en que los halos de inhibición fueron reproducibles intraensayo y hubo diferencias significativas entre la inhibición con el GEL P DG 2601205 y el placebo (p menor 0.001), lo que indica que la actividad del mismo está dada por su componente activo y no por los componentes que constituyen el vehículo del mismo.

Las limitaciones de esta técnica es que no permite establecer la concentración a la cual el producto inhibe al microorganismo y no permite evaluar componentes que no difunden agar (solubles en agua). De todas formas debido a que el objetivo del material en estudio es la inhibición de los microorganismos al contacto directo sobre los mismos (acción tópica) y que el principio activo demostró buena difusión en agar, podemos concluir que la técnica ha sido útil para evaluar la acción antimicrobiana del GEL P DG 2601205

Bibliografía

“Estudio clínico y microbiológico de la enfermedad periodontal del adulto”. Revista Argentina de Microbiología, 33:133-140.

– Nogueira Moreira A, Fernandez Canigia L, Furman C, Chiappe V, Marcantoni M, Bianchini H ( 2001).

Wadsworth anaerobic bacteriology manual, 6th ed. Star Publising Company, Belmont ,CA

Jousimies-Somer H, Summanen P, Citrib DM, Baron EJ, Wexler HM, Finegold SM (2002)

National Committee for Clinical Laboratory Standards (2001). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria. 5th edition. Approved Standard M11-A5, Villanova, USA.

Antibiotics in Laboratory Medicine (1991).

Lorian MD ed. Williams & Wilkins. Baltimore, Maryland, USA. •

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